酰胺是小分子药物中常见的结构，它们通常的制备方法是化学合成法。近年来酰胺的生物合成法也广受关注，如从羧酸出发，使用 ATP 作为活化剂，用连接酶、酰胺键合成酶和羧酸还原酶等酶催化合成酰胺化合物；但由于这些酶催化反应需要使用ATP，而ATP价格贵，导致该法制备酰胺的成本高。

当使用脂肪酶等水解酶进行酰胺合成时，反应通常在有机溶剂中进行，避免酯底物或酰胺产物的水解，或在有机溶剂中在少量水存在下使细胞/酶水合。但是大多数脂肪酶/酯酶表现出有限的底物范围，因为它们不会转化芳香族/大酰基供体，而是更偏好小的酰基团。本文作者的研究目标是找到接受芳香酯作为酰基供体和大分子胺的酶，以便在缓冲液中形成，但挑战在于酶必须优先选择胺作为亲核试剂，而不是高浓度的水，另一个挑战可能是胺在缓冲液中优先以相应的质子化物质的形式存在，因此不易作为亲核试剂进行反应。

本文作者Wolfgang Kroutil的团队研究从脂肪酶/酯酶/酰基转移酶及其变体库中鉴定了一种来源于鞘氨醇单胞菌 HXN-200 (SpL) 的脂肪酶，它能够在水溶液中将多种空间要求高的杂芳族乙酯以及脂肪族胺生成酰胺，分离产率高达 99%，时空产率高达 864 g  L^–1·d^–1；在选定的情况下，酰胺可以在几分钟内生成。该酶的特点是催化三联体的典型丝氨酸旁边有一个天冬氨酸，这对于酰胺的形成至关重要。此外，酶结构揭示了通向活性位点的两条通道，可能一条用于酯，一条用于胺，这允许将空间要求高的杂芳族酯和胺聚集在活性位点中。这项研究表明，从各种五元和六元杂芳族乙酯开始的生物催化生成酰胺可以作为制备酰胺方法。

Wolfgang Kroutil发现的脂肪酶HXN-200 （SpL），可以在水溶液中合成酰胺，且不需要额外添加ATP，反应通式如图1所示。

图1  形成酰胺键的反应通式

为进一步研究SpL酶的结构与催化之间的关系，Wolfgang Kroutil团队通过X射线晶体学技术，发现该脂肪酶的催化结构与传统的三联体（Ser- His-Asp）不同，它是一种催化四联体结构（Asp-Ser-His-Asp），其中的Asp158是形成酰胺的重要位点。酶的表面存在两个通向催化四联体的漏斗状通道，分别是酰基通道和胺通道，如图2a所示，酯类底物会通过酰基通道进入活性位点，而胺亲核试剂则从胺通道进入，减少了两者互相干扰的可能。

图 2 a）SpL中的酰基通道和胺通道 b）PestE (PDB: 2YH2)和Est2 (PDB: 1EVQ)结构与SpL的叠加

Wolfgang Kroutil团队突变了不同水解酶四联体中的Asp，确认了该位点在反应中的作用。Asp158能够形成一种微观静电环境，这是反应中能够形成酰胺的重要原因，具体机理如图3所示，Asp 158处的负电荷能够使得底物中的胺类去质子化，底物中的胺在水溶液中成为亲核试剂并参与后续反应。

图  3 Asp158在酰胺形成过程中的机理

脂肪酶HXN-200 （SpL）能够在水存在的条件下将立体结构的酯和胺有效合成酰胺，扩大了水解酶的用途范围，可以更持续地合成药物和农用化学品所需的酰胺类物质。

脂肪酶HXN-200 （SpL）能够生成的产物如图4所示。

图4 反应的产物范围

具体操作案例：吡啶甲酸乙酯1a投加量为65 mM，苄胺2a投加量为底物的3.5当量，具体的反应式如scheme1所示，该反应在克级制备规模上的分离产率可高达90%，时空产率高达864 g L⁻¹·d⁻¹。

Scheme 1 形成酰胺键的反应方程式

文章来源：

作者信息: Wolfgang Kroutil：https://biodeccodinng.eu/about-us/wolfgang-kroutil.

研究方向：生物催化氧化还原反应和C-C的形成和级联反应。

文章标题：Biocatalytic Heteroaromatic Amide Formation in Water Enabled by aCatalytic Tetrad and Two Access Tunnels.

文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.4c01268.