背景 

酰胺键形成是制药工业中广泛使用的化学反应，因为酰胺基团在药物分子中无处不在，如阿哌沙班、利伐沙班、恩杂鲁胺、奥拉帕尼、瓦达度司他、雷戈非尼、伏利诺司他、伊马替尼等（见图1）。传统的合成方法依赖于高活化状态的羰基化合物，如羧酸、酯或腈，通常需要化学计量偶联剂、恶劣条件和废物处理。酶策略在很大程度上遵循了类似的逻辑，主要包括腈水合、脂肪酶或N-酰基转移酶催化的酯氨解，以及单独或与N-酰基转移酶类催化的酸酰胺化。由于羧酸的容易获得，基于酸的方法最近引起了人们的关注。

图1. 医药分子结构中的酰胺键

近年来，人们开始努力开发从低活化态化合物（如醛或醇）合成酰胺的化学路线（图2），从而扩大了可用前体的范围。特别是，氧化酰胺化提供了一种步骤和原子经济的途径，具有广泛的底物可及性。然而，使用昂贵或有毒的过渡金属催化剂，如钌络合物或铜催化剂，限制了合成应用。相比之下，低活化态前体的生物催化酰胺键形成尚未得到探索。因此，开发一种直接由醛或醇形成酰胺键的生物催化方法将扩大生物催化库，并为复杂生物活性分子的可持续合成提供优势。

图2.化学法合成酰胺键

醛脱氢酶（ALDH）是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）依赖性酶超家族，可将多种脂肪醛和芳香醛氧化成相应的酸。从机理上讲，ALDH催化的转化涉及一个反应级联，包括半硫缩醛的形成、NADP+依赖性硫酯的形成和随后的水解。考虑到硫酯中间体的反应高活性，作者设计在最后一步用胺代替水，使ALDH经过改造后，实现胺对硫酯的亲核攻击，阻止水解反应，从而实现醛合成酰胺。在这项研究中，作者报告了基于理论驱动的ALDHs蛋白质工程，以产生氧化酰胺酶（OxiAms）（图3）。

图3. 从醛脱氢酶设计到氧化型胺化酶路线

作者通过对来源不同的醛脱氢酶进行扫描，最终选择来源于恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的对羟基苯甲醛脱氢酶（PHBDD）有合成酰胺的反应。以对羟基苯甲醛脱氢酶为研究对象，基于氨基酸序列的分析，对保守氨基酸进行了饱和突变，最终筛选到多个突变体（M1,M2,M3）能对不同底物反应。

催化机制与性能优势

图4.酶的催化机理

当底物醛和辅酶NADP+进入到酶的活性口袋后，酶的活性中心残基半胱氨酸的巯基亲核攻击醛基的碳原子，使得碳氧双键打开，形成了富电性的羟基；羟基把电子转移给氧化型的辅酶NADP+,从而辅酶被还原，最终形成活泼的硫酯中间体；在新的氨基化合物进入活性口袋时，氨基会亲核攻击硫酯，使得半胱氨酸的巯基脱落，最终结合上氨基，形成酰胺键化合物（见图4）。

作者将改造过程中获得的突变体（M1,M2,M3具有氧化酰胺化功能）统一命名为OxiAms,分别对OxiAms用不同的杂芳醛底物谱和不同的胺底物谱进行了测试，结果在杂芳醛底物上，六元杂环体系以及喹啉、苯并噻吩、苯并呋喃和苯并噻唑等更大环系都能以良好至优异的产率转化。在胺底物方面，M1-T234G展现出良好的普适性。它能高效催化5-氯吡啶甲醛与碳原子数少于3的伯脂肪胺偶联，在2个当量胺存在下获得70%至78%的产率。另外，作者也将突变体与醇脱氢酶一起偶联实现醇到酰胺键合成的级联反应(见图5)。

图5. 氧化酰胺合成酶的底物谱拓展及酶级联体系开发

药物合成应用验证 

鉴于PHBDD突变体的底物范围很广，作者探索了它们在合成活性药物成分方面的潜力。为了避免NADP+的化学计量消耗并简化合成过程，构建了一株共表达M1-T234G和TpNOX的大肠杆菌菌株，用于细胞内反应。这使得单胺氧化酶抑制剂拉扎贝胺（52）的克级合成产率达到60%（图6A）。同时使用纯化的OxiAm和TpNOX进一步验证了该系统的稳健性，以克为单位合成化合物71，没有产量损失，只有5%的NADP+负载和化学计量胺。

OxiAms还为药物中间体提供了替代途径，为替代逆转录合成策略开辟了机会。Vadadustat（5）是一种贫血药物，传统上由三取代吡啶88分五步合成，总收率为49%（图6B）。关键的酰胺键在羧酸92和甘氨酸甲酯与过量偶联剂CDI之间形成。作者利用化学与酶的结合，突变体PHBDD-M2在甘氨酸缓冲液中有效地将96转化为酰胺97。粗产物97直接进行到下一步，能够以相同的总收率（49%）进行四步vadadustat合成，避免了区域选择性问题和化学计量偶联剂。

甲磺酸伊马替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，用于治疗慢性髓系白血病和胃肠道间质瘤。作者开发了一种化学酶策略，以对苯二甲醛为原料合成伊马替尼中间体48。这种两步法包括顺序的氧化酰胺化和亚胺还原，快速组装骨架100（图6C）。通过筛选M3突变体库，确定M3-P156V-L259M是最有效的突变体。该方法展示了伊马替尼和含有相似骨架的相关药物分子的规模化合成潜力。

图6. 氧化酰胺合成酶在药物合成中的应用

总结

本文通过提出独特的科学思路，利用理性的蛋白质工程技术，将一种ALDH酶改造为催化氧化酰胺化反应的OxiAm酶。同时OxiAms对醛和胺显示出广泛的底物范围，表现出优异的化学和区域选择性以及高催化效率。这种生物催化剂以高产率和可规模化快速获得各种酰胺，为酰胺高效、精准、绿色构造的方向开辟了一条原子经济性高的新生物催化路径。

该生物催化原创性的“氧化酰胺化”策略与工程化酶设计思路，不仅丰富了生物催化的工具库，更为生物制造领域的创新发展提供了全新思路，对推动医药、精细化工等行业向绿色可持续方向转型具有重要的科学意义与工业价值。

参考文献：Gao, L.,et al. Engineered aldehyde dehydrogenases for amide bond formation. Science (2026). DOI: 10.1126/science.adw3365.